Флуоресцентные микроскопы на основе смартфона догоняют по качеству стационарные
Рис. 1. Устройство смартфонного микроскопа

Рис. 1. Устройство смартфонного микроскопа. a — 3D-иллюстрация микроскопа с удаленной задней стенкой; b — схематическое изображение работы микроскопа при наличии слоя серебра на предметном стекле; c, d — лоток для образцов без и с покрытым серебром стеклом; e, f — внешний вид устройства. Изображение из обсуждаемой статьи в Sсientific Reports

Недавно созданный карманный флуоресцентный микроскоп, работающий на основе обыкновенного смартфона, сделал новый скачок в развитии и теперь по качеству может быть сравним с настольным флуоресцентным микроскопом. Помимо оптимизации способа использования этого микроскопа, ученым удалось достичь десятикратного повышения его чувствительности благодаря добавлению в конструкцию металлического покрытия, служащего субстратом для исследуемого образца. Это нововведение привело к способности фиксировать флуоресцентные частицы меньшего размера и с меньшим количеством флуорофоров, то есть с более слабой флуоресценцией.

Для диагностики заболеваний, а также для мониторинга окружающей среды нередко используют современную микроскопию. В простейшем случае кровь, соскоб, слюну, пробу воды и т.п. наносят тонким слоем на стекло и затем исследуют при значительном увеличении светового микроскопа. Так, например, можно выявить наличие раковых клеток по их аномальной форме (к примеру, мазок Папаниколау) или разглядеть в образце патогенные организмы. Для исследования более плотных объектов нужно положить на стекло подготовленный специальным образом тончайший кусочек образца, сквозь который будет хорошо проходить свет.

Чаще всего то, что нам необходимо увидеть на препарате (форму клеток, определенные их части и т.п.), тяжело отличить от других объектов в том же образце из-за сходной плотности и бесцветности многих клеточных структур. Требуется много времени, чтобы разглядеть во множестве имеющихся на препарате клеток именно те, которые интересуют исследователей. Для облегчения этой задачи существуют специальные красители. Различные части препарата окрашиваются с разной интенсивностью, что и позволяет отличить их друг от друга. Иногда для обнаружения определенных клеток помогают молекулы, специфичные для клеток данного типа и не встречающиеся в других местах или встречаются значительно реже. По размеру и расположению областей их концентрации мы можем судить о многом.

В то же время и сами молекулы могут представлять интерес для исследователей, например, когда необходимо выявить, идет ли синтез того или иного вещества в клетке, и определить зоны активного синтеза этого вещества в организме. Однако мы не способны различать эти молекулы глазом, и значительное увеличение светового (до 2000 раз) или даже электронного (до 106 раз) микроскопа в большинстве случаев не помогает. Для многих молекул были найдены или синтезированы вещества, которые связываются только с ними, а их скопления лучше видны под микроскопом, чем неокрашенные клетки или их части. Такие красители, как DAPI или Hoechst, прекрасно связываются с нуклеиновыми кислотами и сами являются флуорофорами, то есть флуоресцируют под действием светового излучения (см. Флуоресцентные репортеры и их репортажи).

Но так ученым везет не часто. Далеко не все связывающиеся с искомыми молекулами вещества могут флуоресцировать или имеют сколь-нибудь заметный окрас. В таком случае к веществу, специфически связывающемуся с искомой молекулой А, приходится дополнительно прилаживать так называемую метку (маркер), делающую это вещество видимым. Маркер может быть радиоактивным (см. Радиоактивный распад) и выявляться с помощью методов радиоавтографии. В роли маркера может выступать тяжелый металл, хорошо поглощающий электроны, что делает его заметным при анализе образца с помощью электронного микроскопа. В качестве метки также часто используют биотин, витамин группы В, или дигоксигенин, вещество из растения наперстянки, которые после обработки щелочной фосфатазой за счет отщепления остатка фосфорной кислоты приобретают синюю окраску. В результате в местах, где есть искомые молекулы А, проявляется окраска, видимая невооруженным глазом или, что бывает чаще, с помощью специальной техники.

Наиболее распространены флуоресцентные маркеры — флуорофоры (см. например, Нобелевская премия по химии — 2008, «Элементы», 10.11.2008), они безопасны для живых организмов и обеспечивают очень быструю передачу сигнала: за секунду одна молекула флуорофора способна излучить миллионы фотонов, детектируемых специальными приборами. Современная техника позволяет увидеть единичные флуоресцентные молекулы, и это делает возможным наблюдение за отдельными мечеными молекулами внутри живой клетки. Также можно применять несколько разных флуоресцентных красителей одновременно и метить разные структуры на одном и том же препарате. Сигналы при правильно подобранных красителях не будут перекрываться, как это часто бывает при использовании маркеров других типов. Некоторые особенности флуоресценции в сочетании с новейшими методами обеспечивают исследователей фотоснимками с высочайшим разрешением, не доступным простой световой микроскопии (см., например, STED-микроскопия, Super-resolution microscopy).

Для анализа флуоресцентной окраски не подходят световые или электронные микроскопы, необходим специальный, флуоресцентный микроскоп. Он оснащен лазером, испускающим на образец свет определенной длины волны для возбуждения флуоресцентных молекул. После возбуждения эти молекулы начинают излучать фотоны света другой длины волны (это и есть их флуоресценция). Они с помощью светофильтра и линз улавливаются и направляются в зависимости от конструкции конкретного микроскопа к детектору или в окуляры.

Размер и стоимость флуоресцентного микроскопа зависит от количества длин волн, с которыми он потенциально может работать, и типа системы отображения полученной информации. Однако даже в самом простом случае настольный флуоресцентный микроскоп — удовольствие недешевое, требующее специального обращения и к тому же маломобильное. Последний факт особенно мешает их использованию в «полевых» условиях. Именно поэтому ученые из разных стран работают над удешевлением и увеличением мобильности таких устройств, чтобы флуоресцентные методы были применимы не только для лабораторных научных исследований, но и для медицинской диагностики, в любых уголках мира.

Одно из последних достижений в этой области — миниатюрные световые и флуоресцентные микроскопы. В создании этих устройств особую роль сыграли смартфоны, легко приспосабливаемые для разных задач. Так, в 2009 году был создан первый основанный на телефоне световой микроскоп (см. Sungkyu Seo, Ting-Wei Su, Derek K. Tseng, Anthony Erlinger and Aydogan Ozcan, 2009. Lensfree holographic imaging for on-chip cytometry and diagnostics). Эта модель представляла собой увеличивающую изображение насадку на телефон, а сам телефон выполнял функцию камеры и системы отображения полученного изображения (рис. 2 A).

Первый способный улавливать флуоресценцию «карманный» микроскоп появился в том же году (D. N. Breslauer, R. N. Maamari, N. A. Switz, W. A. Lam, and D. A. Fletcher, 2009. Mobile phone based clinical microscopy for global health applications). В нем камера смартфона с ее КМОП (комплементарная структура металл-оксид-полупроводник; англ. CMOS, complementary metal-oxide-semiconductor) чипом для обработки изображения выступает в качестве детектора, к которому и направляется флуоресцентное излучение образца (рис. 2 B). Однако отношение сигнала к шуму у такого микроскопа было довольно низким и позволяло детектировать только флуоресцентные частицы диаметром от 100 нм.

<b>Рис. 2.</b> Модели насадок на телефон, преобразующих его в микроскопы различных типов

Рис. 2. Модели насадок на телефон, преобразующих его в микроскопы различных типов: A — световой микроскоп; В — световой и флуоресцентный микроскоп. Изображения из Sungkyu Seo, Ting-Wei Su, Derek K. Tseng, Anthony Erlinger and Aydogan Ozcan, 2009. Lensfree holographic imaging for on-chip cytometry and diagnostics и из D. N. Breslauer, R. N. Maamari, N. A. Switz, W. A. Lam, and D. A. Fletcher, 2009. Mobile phone based clinical microscopy for global health applications, соответственно

В 2013 году исследователи под руководством того же учёного, который создавал первый световой смартфонный микроскоп, разработали новый дизайн смартфонного флуоресцентного микроскопа. Он основан на смартфоне Nokia 1020, спроектирован на компьютере и распечатан с помощью 3D-принтера. В нем по сравнению с моделью 2009 года значительно увеличен угол падения света лазера на образец, что позволило снизить уровень шума и повысить чувствительность прибора (Q. Wei et al., 2013. Fluorescent imaging of single nanoparticles and viruses on a smart phone). Такой микроскоп уже способен детектировать объекты нанометровых размеров, в том числе визуализировать отдельные молекулы ДНК. Создатели также разработали специальное приложение, позволяющее отправлять полученные данные для анализа на сервер с возможностью последующего отображения результатов этого анализа на экране телефона (Q. Wei et al., 2014. Imaging and sizing of single DNA molecules on a mobile phone). К сожалению, и эта конструкция все еще значительно уступает по чувствительности обычным стационарным (настольным) микроскопам (рис. 3a, b). Поэтому исследовательская группа, разработавшая данный дизайн микроскопа, продолжает работать над его улучшением.

Совместно с учеными из Германии эта группа провела анализ всех условий, оказывающих влияние на чувствительность данной конструкции к флуоресценции, и нашла оптимальные угол и положение камеры, а также образца и лазера относительно друг друга. Кроме того, значительного улучшения по сравнению с предшествующей моделью удалось добиться благодаря тонкой алюминиевой пленке (30–50 нм), разделяющей образец и предметное стекло, на которое он помещается. Ранее образец располагали прямо на стекле. Дело в том, что слой металла и диоксида кремния (SiO2) при возбуждении флуоресцентным светом от образца создают так называемые плазмоны — электромагнитные волны, амплитуда которых спадает по мере удаления от поверхности раздела сред. Эти волны позволяют значительно усилить электромагнитное поле и исказить сигнал от флуоресцентных частиц на КМОП-чип и соответственно на экран смартфона в пользу большего отношения сигнала к шуму, то есть большей контрастности. Наилучший результат такой микроскоп дает при толщине алюминиевого слоя в 50 нм (t), толщине слоя диоксида кремния в 30 нм (d) и угле падения луча на образец 58° при используемой длине волны около 470 нм (рис. 1 b).

В качестве флуоресцентных частиц исследователи использовали ДНК-оригами (см. DNA origami). Эти трехмерные структуры имеют наноразмеры и могут быть сконструированы в соответствие с задумкой исследователей. Так, авторы статьи задали одним ДНК-оригами быть способными связываться с 80 флуорофорами , другим — с 42, третьим — с 25. При этом размер частиц остается неизменным, а поскольку свечение одинаковых флуорофоров суммируется, полученные частицы отличаются друг от друга по яркости их флуоресценции. Это позволило оценить, какое минимальное количество красителя на пятно рассеяния необходимо для детекции искомого вещества A.

Усовершенствованный смартфонный микроскоп показал значительное повышение чувствительности по сравнению с предыдущей версией. На рисунке 3 видно, что при помещении образца на не покрытое алюминием стекло многие флуоресцентные частицы, видимые с помощью настольного микроскопа, просто не детектируются (рис. 3 a, b). При использовании же серебряной пленки для предметного стекла бо́льшая часть таких частиц становится видимой (рис. 3 c–f).

<b>Рис. 3.</b> Изображение отдельных флуоресцентных частиц (см. <a href=/"https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_origami" target=_blank>DNA origami</a>), помеченных 80±4 флуорофорами каждая

Рис. 3. Изображение отдельных флуоресцентных частиц (см. DNA origami), помеченных 80±4 флуорофорами каждая. a, b — один и тот же участок препарата, отснятый с помощью настольного микроскопа и с помощью смартфонного микроскопа на предметном стекле без серебряной пленки; с, е — снимки, сделанные с помощью настольного микроскопа; d, f — снимки того же препарата, сделанные с помощью усовершенствованного смартфонного микроскопа с использованием серебряной пленки. Голубые кривые демонстрируют интенсивность сигнала. Изображение из обсуждаемой статьи в Scientific Reports

Кроме того, новая методика позволяет детектировать флуоресцентные частицы меньшего диаметра. Предыдущая версия не всегда позволяла детектировать частицы диаметром 50 нм. Теперь почти с той же точностью, что и с помощью настольного флуоресцентного микроскопа, детектируются частицы размером 23 нм, окрашенные 80ю молекулами флуорофора каждая. Частицы с вдвое меньшим количеством флуорофоров и тем же размером тоже детектируются улучшенным микроскопом, однако примерно в два раза реже, т.к. имеют меньшую светимость (рис. 4).

<b>Рис. 4.</b> Чувствительность смартфонного флуоресцентного микроскоп

Рис. 4. Чувствительность смартфонного флуоресцентного микроскопа с покрытым серебром предметным стеклом по сравнению с настольным микроскопом, определенная по числу детектированных флуоресцентных частиц ДНК-оригами, помеченных 80±4, 42±10 и 25±16 флуорофорами, соответственно, на одном и том же участке препарата. Изображение из обсуждаемой статьи в Scientific Reports

Открытие и изобретение новых методов и технологий идет полным ходом. По замыслу создателей, улучшенный смартфонный микроскоп может быть использован для диагностики ряда заболеваний, таких как ВИЧ и малярия, для экологического контроля и прочего. Вместе со смартфоном он весит всего 370 грамм, а средняя его стоимость авторами оценивается в 270$, не считая фильтр. Все это делает его перспективным, дешевым и мобильным заменителем стационарного флуоресцентного микроскопа. Описанный же в обсуждаемой статье метод улучшения микроскопа не требует никаких значительных перестроек конструкции, а лишь нанесения серебра и диоксида кремния на стекло. Эта процедура относительно проста и недорога, поэтому вряд ли станет главным препятствием выходу данного микроскопа на рынок.

Источник: Qingsha Wei, Guillermo Acuna, Seungkyeum Kim, Carolin Vietz, Derek Tseng, Jongjae Chae, Daniel Shir, Wei Luo, Philip Tinnefeld & Aydogan Ozcan. Plasmonics Enhanced Smartphone Fluorescence Microscopy // Scientific Reports. 2017. V. 7. Article number: 2124.

О методах микроскопии см. также:
1) Достигнут новый предел разрешения рентгеновского микроскопа, «Элементы», 15.09.2008
2) Физики создали настольный рентгеновский микроскоп, «Элементы», 16.10.2009
3) Микроскоп XXI века: молекулы живой клетки в режиме реального времени, «Элементы», 29.10.2014
4) Создана насадка на смартфон для молекулярной диагностики, «Элементы», 16.04.2015

Алёна Сухопутова

Read Full Article