Рис. 1. Типичная колония жгутиконосца B. monosierra из образца воды озера Моно. Ядра жгутиконосцев и бактериальные нуклеоиды (примеры указаны стрелками) заметны при окрашивании Hoechst (голубой). Окрашивание конканавалином А (пурпурный) показало разветвленный внеклеточный матрикс. Длина масштабного отрезка — 10 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи

Хоанофлагелляты, или воротничковые жгутиконосцы (Choanoflagellata), — это своеобразная группа протистов, которая родственна животным и грибам. По всей видимости, когда-то давно именно колониальные воротничковые жгутиконосцы дали начало первым из этих многоклеточных, однако как именно — остается загадкой. Авторы новой публикации обнаружили в соленом щелочном озере Моно (США) своеобразную природную модель симбиотической системы с участием жгутиконосцев. Описанный новый вид и род Barroeca monosierra образует очень крупные по меркам воротничковых жгутиконосцев колонии, в центре которых живет множество прокариот, — главным образом альфа-протеобактерии. Необычную симбиотическую систему удалось успешно культивировать в лабораторных условиях.

Протисты — это множество разнообразных и неродственных групп одноклеточных эукариот с различными типами питания: фотосинтетическим («растительным»), сапротрофным («грибным») или фаготрофным («животным»). Различных одноклеточных гетеротрофов традиционно называли «простейшими». Эти организмы возникли более чем 1,8 миллиарда лет назад и были первыми ядерными, которые состояли из единственной клетки (A. Robin et al., 2021. Major Evolutionary Transitions and the Roles of Facilitation and Information in Ecosystem Transformations). Образование весьма разнообразных систематических групп и жизненных форм протистов пришлось на протерозойский эон, большую часть которого они были одними из самых сложных существ на Земле.

Особый интерес с точки зрения макроэволюции вызывает тип хоанофлагеллят (или воротничковых жгутиконосцев), который считают прародителем современных животных (Расшифрован геном хоанофлагеллят — ближайших одноклеточных родичей всех многоклеточных животных, «Элементы», 18.02.2008). Название «Choanoflagellata» образовано от греческого слова «воронка» и латинского «жгутик», что отражает основные особенности их клеток. Они имеют округлую или яйцевидную форму и сравнительно невелики — в среднем от трех до 10 микрометров, что много меньше чем у других протистов вроде амеб или инфузорий (S. Geisen et al., 2017. Soil protistology rebooted: 30 fundamental questions to start with). Некоторые хоанофлагелляты живут в бокаловидных домиках-теках, которые строят из полисахаридов, в том числе целлюлозы (она обычно встречается у растительных клеток). Для воротничковых жгутиконосцев характерна отчетливая полярность клетки — два ее «конца» резко отличаются (рис. 2). На «верхнем» находятся единственный крупный жгутик, окруженный воротничком из микроворсинок (микровиллей), а «нижний» служит для прикрепления к субстрату. Такая конструкция придает хоанофлагеллятам узнаваемый облик и нужна для питания: жгутик создает ток воды, который приносит к ворсинкам бактерии и взвешенные частицы детрита. Те оседают на цитоплазматической мембране и потребляются путем фагоцитоза.

Рис. 2. Эволюционные связи, морфология и разнообразие хоанофлагеллят. (a) — хоанофлагелляты — ближайшие одноклеточные родственники животных и грибов. Белым кружком показан последний общий предок хоанофлагеллят и животных. (b) — морфология хоанофлагеллят и расположение их органелл: bb — базальное тельце; mt — митохондрии; fv — пищеварительная вакуоль. (c) — хоанофлагеллят делят на два порядка: Craspedida и Acanthoecida. Среди Craspedida встречаются одноклеточные, а также колониальные виды (например, Salpingoeca rosetta), в том числе прикрепленные к субстрату (Codosiga botrytis). Для Acanthoecida характерно наличие скелета (тека) в форме корзинки. В этот порядок входят два семейства: «голые» Acanthoecidae (например, Acanthoeca spectabilis) и имеющие теку Stephanoecidae (Stephanoeca diplocostata). Рисунок из статьи T. Hoffmeyer, P. Burkhardt, 2016. Choanoflagellate models — Monosiga brevicollis and Salpingoeca rosetta

Некоторые жгутиковые ведут одиночный образ жизни, тогда как другие образуют колонии. Это своеобразная форма организации живого, занимающая переходное положение между одноклеточными и многоклеточными организмами, которые имеют настоящие специализированные ткани и органы. Хрестоматийный пример колониальных протистов — вольвокс (Volvox sp.), состоящий из множества клеток зеленых водорослей, соединенных цитоплазматическими мостиками в сферическую колонию. В колонии есть начальная специализация клеток: большинство заняты фотосинтезом и перемещением колонии за счет движения торчащих наружу жгутиков, тогда как другие нужны для размножения. Примерно так же устроены колонии воротничковых: комплекс из жгутика и ворсинок каждой обращен наружу, а тела их клеток образуют монослой, — это и есть «стенка» колонии. Соседние клетки соединяют тяжи мембран, которые находятся чуть ниже клеточного «экватора». Внутренняя часть колонии (люмен) может быть заполнена тяжами внеклеточного матрикса.

Рис. 3. Бактерии-симбионты, которые обитают в колониях жгутиконосцев Barroeca monosierra. A и A′ — центр колонии, изображение с максимальной интенсивностью (A) и оптическое сечение вдоль оси z (A′). Видна окраска ДНК красителем Hoechst 33342 (голубой цвет). Апикальные жгутики помечены антителами к тубулину, специфичному белку микротрубочек (белый); микроворсинки окрашены фаллоидином (красный). Hoechst 33342 окрасил сферические ядра жгутиконосцев по периметру колонии и размытое пятно ДНК в ее полости. B и B′ — тонкий срез колонии B. monosierra, полученный с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), показал наличие мелких клеток в центральной полости. На врезке B′ видно, что внутренние клетки имеют клеточную стенку. C, C′, C′′ и C′′′ — мелкие клетки внутри колоний B. monosierra являются бактериями, что показала in situ гибридизация с флуоресцентным зондом к 16S рРНК (изображение C, зеленый) и зондом, распознающим гамма-протеобактерии (изображение C′, красный). Ядра жгутиконосцев и бактериальные нуклеоиды (ДНК) видны при окрашивании Hoechst (изображение C′, голубой). C′′′ — наложение панелей C, C′ и C′′. Длина масштабных отрезков на вышеперечисленных рисунках — 5 мкм. D, D′ и D′′ — трехмерная реконструкция 70-клеточной колонии B. monosierra на основе ПЭМ и серийных ультратонких срезов показала, что бактерии тесно связаны с внеклеточным матриксом (ECM) внутри колонии и обернуты в него. D — вид колонии целиком. D′′ — вид центра колонии в разрезе. Ложными цветами обозначены клеточные тела (голубой), микроворсинки (оранжевый), жгутики (зеленый), бактерии (красный), ECM (белый), межклеточные мостики (желтый) и нитевидные выросты протистов — филоподии (фиолетовый). D′′ — изображение с уменьшенной прозрачностью показывает бактерии между боковыми поверхностями клеток жгутиконосцев (показано скобками). Изображение из обсуждаемой статьи

Известен целый ряд колониальных воротничковых, однако статья в журнале mBio впервые охарактеризовала такие организмы из водоема с экстремальными условиями — гиперсоленого щелочного озера. Ученые из США, Великобритании, Норвегии и Испании описали новый род и вид — Barroeca monosierra (рис. 1, 3, 4). Родовое название дали в честь выдающегося исследователя хоанофлагеллят Бэрри Лидбитера (Barry S. C. Leadbeater) с добавлением часто используемого для этой группы суффикса «-oeca». Видовой эпитет отсылает к месту находки — озеру Моно, которое расположено на высоте более 1900 метров над уровнем моря в горах Сьерра-Невада в Калифорнии (США) (рис. 4). Помимо способности жить в рассоле с высоким pH и содержанием мышьяка, описанный организм имеет и другие уникальные черты, в том числе — размер колонии. Если у родственного протиста Salpingoeca rosetta они варьируют от 10 до 30 микрометров, то у B. monosierra диаметр колонии может достигать 125 мкм и варьирует на целый порядок (медианное значение — 25 мкм; рис. 3, F). Длина тела клетки B. monosierra составляет 6–7 мкм, жгутика — 20–25 мкм, высота воротничка из микроворсинок — 7,5–9,5 мкм. Некоторые клетки имеют у основания бокаловидный скелет (теку) с ножкой длиной около 30 мкм. Цитоплазматические мостики, которыми соединены протисты в колонии, достигают в длину 0,3–0,5 мкм при толщине 0,2–0,3 мкм.

Рис. 4. Колониальные хоанофлагелляты B. monosierra из озера Моно. A — протисты были пойманы в трех местах отбора проб (звездочки) у берега озера Моно, Калифорния (карта по данным сайте usgs.gov). B — хоанофлагелляты B. monosierra образуют очень крупные колонии (дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия). Длина масштабного отрезка — 50 мкм. C — вид B. monosierra (выделен жирным шрифтом) близок хоанофлагеллятам S. rosetta и Microstomoeca roanoka. Филогения основана на последовательностях трех генов: 18S рРНК, кодирующих белки EFL и HSP90. Многоклеточные животные (семь видов) на схеме для удобства объединены. Над каждой ветвью указаны байесовские апостериорные вероятности, ниже показана бутстрап-поддержка максимального правдоподобия. D и E — на примере двух колоний показаны пределы размеров колоний B. monosierra: диаметр колонии на изображении D — 58 мкм; диаметр колонии на изображении E — 19 ; длина масштабного отрезка — 20 мкм. В колониях B. monosierra каждая клетка ориентирована так, что ее апикальный жгутик (белый; помечен антителами к тубулину) и апикальный воротничок микроворсинок (красный; окрашен фаллоидином) смотрят наружу. Ядра с ДНК (голубые) окрашены Hoechst 33342. F — диаметр колоний B. monosierra варьирует от 10 мкм, что сравнимо с размером мелких колоний S. rosetta, до 120 мкм. Размеры колоний B. monosierra и S. rosetta изображены в виде графика violin plot; медиана обозначена жирной линией. Изображение из обсуждаемой статьи

Однако самое интересное выяснилось, когда ученые использовали флуоресцентный краситель Хёхст (Hoechst 33342), который избирательно окрашивает ДНК. Под микроскопом, как и следовало ожидать, голубым засветились ядра B. monosierra, однако скопления ДНК заметили также в центральной части колонии, где обычно нет каких-либо клеток. С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) там удалось увидеть мелкие (до одного микрометра) клетки разной формы (рис. 1). Это означало, что колонию помимо хозяев-протистов населяют многочисленные бактерии. Предположение подтвердила флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с применением зондов, специфичных к бактериальной 16S рибосомальной РНК. Более специфичный зонд к 16S-рРНК гамма-протеобактерий показал, что большинство прокариот внутри колоний относятся именно к этому классу. Далее путем культивирования B. monosierra в среде с флуоресцентно мечеными D-аминокислотами (вместо обычно образующих белки L-оптических изомеров), которые способны встраиваться в клеточные стенки бактерий, ученые доказали, что те живы и продолжают делиться.

Более полную картину дали серии оптических срезов, полученных с помощью ПЭМ для реконструкции трехмерной структуры колонии B. monosierra. Оказалось, что она образована одноклеточным слоем из примерно 70 клеток протистов, которые имеют стандартную ориентацию жгутиков и воротничков наружу, а также сеть соединяющих их ветвящихся тонких мостиков. Число бактерий в колонии оказалось больше — не менее 200 клеток, по большей части в центральной области. Некоторые были прикреплены к внеклеточному матриксу внутри колонии B. monosierra или даже в него обернуты. Часть бактерий застряли между боковыми поверхностями клеток протистов — они могли попасть туда как извне, так и из просвета колонии.

Предстояло выяснить, как именно бактерии могли пробраться в колонию протистов. Такой процесс может быть активным или пассивным, избирательным или неизбирательно переносящим любые частицы близкого размера, а не только бактерии. К счастью, колонии B. monosierra удалось культивировать в лаборатории, причем это не помешало им сохранить симбионтов. Более того, количество прокариот в них только возрастало. Авторы провели эксперименты, в ходе которых инкубировали протистов в среде с латексными микросферами, покрытыми молекулами бычьего сывороточного альбумина. По размеру они были близки небольшим бактериальным клеткам — от 0,2 до 1 мкм. Искусственные микросферы не смогли проникнуть внутрь колоний, что говорит об активном характере переноса бактерий внутрь. Выходит, в нем участвуют специфические биологические процессы.

Поскольку бактерии могли попасть внутрь колоний воротничковых только из воды озера Моно, — среды своего обитания, — ученые секвенировали ее метагеном, геномы бактерий-симбионтов B. monosierra и самих протистов. Для 22 филотипов — совокупностей бактерий, имеющих черты сходства и родственные связи, — которыми были обогащены микробиомы хоанофлагеллят на основании консервативных 16S рРНК построили филогенетическое древо. Оказалось, что внутри колоний поселились только некоторые из бактерий, живущих в озере Моно, причем их набор довольно специфичен. В нем преобладают представители семейства пурпурных серных бактерий Ectothiorhodospiraceae, которые способны к аноксигенному фотосинтезу. В то же время обильные в озере бактерии из класса Spirochaete (хемоорганогетеротрофы с различным отношением к кислороду) и разнообразного типа Bacteroidota внутрь B. monosierra не проникли (рис. 5).

Рис. 5. Филотипы гамма- и альфа-протеобактерий, ассоциированные с B. monosierra. Неукорененное филогенетическое дерево построено на основе 16 соединенных последовательностей рибосомальных белков, представляющих бактериальных симбионтов в культивируемых колониях B. monosierra и бактерий из водоема. Масштабный отрезок показывает среднее число замен для положения последовательности. Обозначенные бактерии принадлежат к четырем основным классам: Spirochaetia, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Bacteroidetes. Однако в колониях B. monosierra обнаружены только Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria. Кружочки показывают бактерии из воды озера Моно (белые) и бактерии, ассоциированные с хоанофлагеллятами (Oceanospirillaceae sp., пурпурный; Saccharospirillaceae sp., зеленый; Ectothiorhodospiraceae sp., синий; Roseinatronobacter sp., оранжевый). Исходные данные для построения дерева — в сопроводительных материалах. Изображение из обсуждаемой статьи

Единственный микроорганизм из галофильного семейства Oceanospirillaceae был обнаружен исключительно внутри колоний B. monosierra, но не в водах озера Моно. Подавляющее большинство бактерий-симбионтов — это гамма-протеобактерии, имеющие морфологию от палочковидных до нитевидных. Только один из филотипов, обозначенный как OceaML1 и тоже относящийся к Oceanospirillaceae, был найден во всех исследованных колониях. Эта бактерия — также самая массовая: на нее приходится 66,4% от общего числа симбионтов. Вторым по распространенности стал штамм SaccML из семейства Saccharospirillaceae (найден в 93,3% колоний жгутиконосцев), далее шли пурпурные серные бактерии EctoML3 (91,8%) и EctoML1 (82,4%) — обе из семейства Ectothiorhodospiraceae. Другая крупная группа прокариот — альфа-протеобактерии — представлена единственным видом RoseML, который встречался в единичных колониях протистов и был малочисленным.

Предстоит выяснить, насколько описанное бактериальное население у B. monosierra в культуре соответствует тому, которое содержат протисты в природе. Однако несомненно, что новая симбиотическая система — это ценная модель для изучения взаимодействий разных микробов, прокариот и протистов. Дальнейшие работы помогут понять, каким «по знаку» (то есть влиянию друга на друга) следует считать этот симбиоз: мутуалистическим (++), комменсальным (+0) или иным. Очевидно, что бактерии играют очень важную роль в жизни хоанофлагеллят: это их основная пища и клетки, с которыми они постоянно взаимодействуют и развиваются в коэволюции. Более того, метаболит бактерий (хондроитиназа) запускает у родственного вида воротничковых S. rosetta половое размножение (A. Woznica et al., 2017. Mating in the Closest Living Relatives of Animals Is Induced by a Bacterial Chondroitinase). И это лишь отдельные фрагменты сложной картины взаимодействий двух разных типов клеток.

Изучение эволюции и разнообразных адаптаций хоанофлагеллят имеет и более общее значение. Дело в том, что именно такие протисты считаются ближайшими родственниками животных и грибов, — сейчас все эти организмы объединены в одну группу Заднежгутиковые (Opisthokonta). Их роднит именно единственный «фирменный» жгутик на конце клетки, который организм имеет хотя бы на некоторых стадиях жизненного цикла. А еще хоанофлагелляты чрезвычайно похожи на клетки губок — хоаноциты, — которые обеспечивают питание этих своеобразных и просто устроенных организмов. Поэтому симбиотические взаимодействия современных микроорганизмов могут пролить свет на один из самых сложных вопросов эволюции — появление самых примитивных животных.

Источник: K. H. Hake, P. T. West, K. McDonald, D. Laundon, J. Reyes-Rivera, A. Garcia De Las Bayonas, C. Feng, P. Burkhardt, D. J. Richter, J. F. Banfield, N. King. A large colonial choanoflagellate from Mono Lake harbors live bacteria // mBio. 2024. DOI: 10.1128/mbio.01623-24.

Михаил Орлов